引言：方法開發(fā)是個(gè)復(fù)雜而又神秘的工程，往往需要扎實(shí)的理論知識(shí)儲(chǔ)備，但同時(shí)也少不了經(jīng)驗(yàn)的積累；對(duì)于方法開發(fā)，需要我們從多學(xué)科出發(fā)，分析儀器學(xué)、色譜學(xué)、藥學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)等學(xué)科綜合，也需要我們熟練掌握文獻(xiàn)信息檢索，從中吸取精華，同時(shí)不斷去試錯(cuò)，下面就把我個(gè)人職業(yè)生涯的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)提煉，供同行一起學(xué)習(xí)探討，有不足之處需要同行前輩予以指正。
一、確認(rèn)開發(fā)工作內(nèi)容
1.殘留溶劑檢測(cè)分析方法：GC-HS方法、GC直接進(jìn)樣方法
2.基因毒雜質(zhì)檢測(cè)分析方法
3.高沸點(diǎn)樣品雜質(zhì)分離與含量檢測(cè)方法
二、信息收集
1.首先要確定待測(cè)物質(zhì)的溶解性、極性、沸點(diǎn)，主要針對(duì)“溶劑殘留”；
2.其次還需要確定樣品的溶解性、熱穩(wěn)定性、極性、沸點(diǎn)、化學(xué)性質(zhì)（酸堿）、物理屬性（固體/液體/半固態(tài)）。
三、色譜柱使用選擇指南（分離關(guān)鍵）
四、進(jìn)樣方法的選擇
1.方法有：溶液直接進(jìn)樣法、頂空進(jìn)樣
①殘留溶劑-HS：大多數(shù)是低沸點(diǎn)物質(zhì)（醇/酯/烷烴/醚），90%以上采用頂空進(jìn)樣（GC-HS），清潔進(jìn)樣，基本不出雜峰（溶劑），原料不被破壞但經(jīng)濟(jì)費(fèi)用高。
②殘留溶劑-DS：5%及少數(shù)采用溶液直接進(jìn)樣（GC-DS），經(jīng)濟(jì)，但出雜峰多（主要原料破壞帶入），易損壞色譜柱需清潔老化保護(hù)。
③開發(fā)選擇考慮總結(jié)：
2.溶劑沸點(diǎn)過高（沸點(diǎn)大于180℃），且樣品對(duì)熱比較穩(wěn)定首選溶液直接進(jìn)樣法；
3.溶劑沸點(diǎn)低（沸點(diǎn)小于150℃），且樣品對(duì)熱不穩(wěn)定首選頂空進(jìn)樣法；
4.頂空進(jìn)樣法可消除因溶液直接進(jìn)樣會(huì)產(chǎn)生降解雜質(zhì)峰而干擾目標(biāo)峰（進(jìn)樣口溫度大于200℃），采用頂空進(jìn)樣方法還可以減少對(duì)樣品的預(yù)處理。
5.基因毒雜質(zhì)方法開發(fā)，優(yōu)先選擇溶液直接進(jìn)樣法（限度低，主要考慮提高靈敏度）；樣品雜質(zhì)分離選擇使用溶液直接進(jìn)樣法。
6.對(duì)于基因毒雜質(zhì)限度小于2ppm以下方法開發(fā)，優(yōu)先選擇GC-MS溶液直接進(jìn)樣法。
五、確定定量方法
1.外標(biāo)法：殘留溶劑、含量（準(zhǔn)確）
2.內(nèi)標(biāo)法：殘留溶劑（主要針對(duì)易揮發(fā)烷烴類）
3.面積歸一化法：樣品雜質(zhì)分離及純度
六、樣品預(yù)處理方法
1.氣相色譜儀能直接分析的樣品通常是氣體或液體，固體樣品在分析前應(yīng)當(dāng)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲校疫€要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機(jī)鹽：進(jìn)樣口溫度不能保證鹽汽化），往往會(huì)聚集在進(jìn)樣口襯管或分流平板導(dǎo)致污染/堵塞，還有可能通過載氣進(jìn)入色譜柱中，損壞色譜柱的填料。
2.樣品預(yù)處理/溶解原則：根據(jù)相似相溶原理。
3.樣品分類：氣體樣品、液體樣品、固體樣品。
4.氣體/液體樣品預(yù)處理方法：
①直接進(jìn)樣分析（純度分析與檢測(cè)），如：甲烷、乙醇；
②脂溶性液體樣品（雜質(zhì)），通常需要用脂溶性有機(jī)溶劑溶解樣品，如：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、DMSO、DMF；
③進(jìn)樣方式：溶液直接進(jìn)樣、頂空進(jìn)樣。
5.固體樣品（含鹽）樣品預(yù)處理方法：
①樣品性質(zhì)：易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，樣品熔點(diǎn)高，難汽化，如：鈉鹽/鉀鹽/鹽酸鹽/硫酸鹽/磷酸鹽/富馬酸鹽；
②如果選擇水作溶劑-盡量使用頂空進(jìn)樣方法；
③靈敏度不理想且限度低（1-10ppm）-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法來進(jìn)行預(yù)處理樣品，這樣既可以溶液直接進(jìn)樣又可以頂空進(jìn)樣，檢測(cè)雜質(zhì)/殘留/基因毒通用。
七、溶劑系統(tǒng)選擇
1.如果是溶液直接進(jìn)樣法，優(yōu)先考慮溶劑選擇，溶解樣品的溶劑和最大溶解限度；如果是頂空進(jìn)樣法，可根據(jù)樣品和溶劑都能溶解；
2.原則上水溶性樣品優(yōu)先選擇水，非水溶性樣品可選擇酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC；
3.溶液直接進(jìn)樣-樣品溶劑選擇考慮：
①化學(xué)穩(wěn)定（水解/醇解），優(yōu)先選擇水（水溶性）/醇/酯（脂溶性）作為溶劑；反之選擇烷烴、質(zhì)子溶劑（萬能溶劑：DMF、DMSO、NMP、DMAC）；
②樣品具有酸/堿性，但是檢測(cè)殘留溶劑或雜質(zhì)也具備酸/堿性，可根據(jù)待測(cè)物質(zhì)酸/堿性質(zhì)選擇酸堿中和樣品；如鹽酸/硫酸/富馬酸鹽等產(chǎn)品檢測(cè)胺類，需要單獨(dú)使用堿性溶劑進(jìn)行中和解離，同樣反之，如吡啶/鈉/鉀鹽等產(chǎn)品檢測(cè)酸類，需要單獨(dú)使用酸性溶劑進(jìn)行中和解離（具體溶劑選擇，需要進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)）。
③供試品溶液要澄清，不與樣品及待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)或結(jié)合。
4.頂空進(jìn)樣-樣品溶劑選擇考慮：
①化學(xué)穩(wěn)定（水解/醇解），優(yōu)先選擇水（水溶性）作為溶劑；反之選擇質(zhì)子溶劑（萬能溶劑：DMF、DMSO、NMP、DMAC）；
②樣品具有酸/堿性，同上“3.②”。
③樣品溶解完全沒要求,頂空進(jìn)樣氣體（溶劑殘留）。
5.對(duì)于低限度燃燒值大的物質(zhì)，可選用鹽析溶劑系統(tǒng)，如：苯殘留、三氯甲烷。
6.樣品溶解溶劑選擇，也要考慮殘留溶劑的溶解度（如：烷、醚類不溶解水）。
7.大部分溶劑系統(tǒng)優(yōu)先選擇DMSO、NMP、DMF，因?yàn)榧饶苋芙鈽悠酚帜苋芙馊軇?/p>
八、柱溫開發(fā)研究
1.等溫：對(duì)于溶劑個(gè)數(shù)?。?-3個(gè)），且各溶劑沸點(diǎn)差異不算很大，此時(shí)可選擇等溫法，比如50℃保持10-15分鐘（適合殘留溶劑檢測(cè)、基因毒雜質(zhì)檢測(cè)、含量測(cè)定）；
2.程序升溫：對(duì)于溶劑個(gè)數(shù)多（大于5個(gè)），且各溶劑沸點(diǎn)差異較大，此時(shí)可選擇程序升溫法，比如40℃保持10分鐘，以10℃/min速率升至180℃，保持5分鐘（適用于產(chǎn)品雜質(zhì)分離、殘留溶劑檢測(cè)）；
3.極端分離：對(duì)于大部分沸點(diǎn)低溶劑（當(dāng)使用DB-624）且考慮分析時(shí)長(zhǎng)時(shí)，可選用低溫程序升溫法，比如初始35-40℃（分析環(huán)境一定要保證＜25℃）；
4.經(jīng)典程序升溫（殘留溶劑、雜質(zhì)分離）：
九、頂空條件方法選擇和研究
1.爐溫（加熱-頂空瓶平衡溫度）：
①以水為溶劑，溫度選擇范圍75-90℃，最高選擇90℃；
②以DMSO、DMF等為溶劑，溫度選擇范圍80-145℃，最高選擇140℃；溫度過高要考慮高溫時(shí)長(zhǎng)導(dǎo)致溶劑反應(yīng)降解產(chǎn)生新的未知雜峰；
③考慮溫度過高有爆瓶危險(xiǎn)，特別在使用鹽析方法時(shí)（因?yàn)槿軇┫到y(tǒng)里水分存在）爆瓶概率增加；
④加熱溫度研究最高溫度一般低于溶劑10℃（在考慮靈敏度情況下）。
2.定量環(huán)溫度：溫度要大于爐溫10℃；
3.傳輸線溫度：溫度要大于定量環(huán)溫度10℃；
4.頂空瓶（加熱）平衡時(shí)間：根據(jù)大部分溶劑沸點(diǎn)，沸點(diǎn)都相對(duì)高平衡時(shí)間就長(zhǎng)，沸點(diǎn)相當(dāng)都低平衡時(shí)間就短；常規(guī)平衡時(shí)間為30-60分鐘，經(jīng)典平衡時(shí)間為30分鐘。
十、檢測(cè)器選用
1.90%分析方法工作優(yōu)先選用FID檢測(cè)器：含碳?xì)浠衔?/p>
2.基因毒雜質(zhì)選用FID-MS檢測(cè)器
3.如含電負(fù)性基團(tuán)（F/Cl/Br）且含CH量少，選用ECD電子捕獲檢測(cè)器，如三氯甲烷無H物質(zhì)
4.含有非碳?xì)浠衔锝M分時(shí)，且對(duì)檢測(cè)靈敏度要求不高，通常選擇TCD檢測(cè)器，主要?dú)怏w檢測(cè)，如輔材：氮?dú)?/p>
十一、方法建立
1.進(jìn)樣口溫度：一般選擇200-230℃，進(jìn)樣口溫度要大于傳輸線溫度，可根據(jù)樣品性質(zhì)研究選用中高溫，如150-180℃（考慮樣品不被熱解）；
2.檢測(cè)器溫度：一般230-260℃。檢測(cè)器溫度要大于進(jìn)樣口和色譜柱溫度；
3.流速：3.0-5.0mL/min，經(jīng)典流速為：4和5mL/min；
4.分流比：①5:1-50:1；②選擇規(guī)則-響應(yīng)值高大分流比，反之則小分流比；③經(jīng)典分流比為5:1（頂空進(jìn)樣）和50：1（溶液直接進(jìn)樣）；
5.進(jìn)樣量：頂空進(jìn)樣-1mL，溶液直接進(jìn)樣-0.2-1uL，也可根據(jù)進(jìn)樣峰型進(jìn)行改進(jìn)；
6.樣品濃度/配制開發(fā)研究：
①頂空進(jìn)樣：0.2-1g（根據(jù)限度/靈敏度要求進(jìn)行研究），對(duì)于大濃度要考察樣品提取平衡；濃度一般控制在0.1-0.4g/mL（頂空裝量控制在1-5mL）；
②溶液直接進(jìn)樣：一定要考慮溶解完全，濃度可根據(jù)限度/靈敏度要求進(jìn)行開發(fā)研究；一般控制在0.5-200mg/mL；
③開發(fā)研究合適的樣品濃度，一定要根據(jù)雜質(zhì)限度/靈敏度做相應(yīng)研究調(diào)整。
7.對(duì)于雜質(zhì)分離（溶液直接進(jìn)樣法），在方法開發(fā)同時(shí)也要考察殘留問題，可增加清洗老化色譜柱方法程序，也可增加清洗進(jìn)樣針方法；還有對(duì)于對(duì)氣相管路有吸附殘留性質(zhì)也可增加清洗程序（如胺類、＞150℃高沸點(diǎn)物質(zhì)），增加程序一定要作為分析方法的一部分，且一定要經(jīng)過驗(yàn)證驗(yàn)收。
8.系統(tǒng)干擾考察研究：先走空白2針，樣品1針、對(duì)照1針，查看空白、樣品溶液的干擾情況，空白與樣品應(yīng)無干擾峰出現(xiàn)（方法驗(yàn)證-專屬性），且對(duì)LOQ和LOD測(cè)試無干擾，基本能通過LOQ和LOD驗(yàn)證（方法好壞體現(xiàn)在系統(tǒng)與溶劑對(duì)測(cè)試的干擾）；
9.最后進(jìn)行100%加標(biāo)回收測(cè)試，回收結(jié)果如果滿足90%-105%，方法基本確定。
十二、分析方法評(píng)價(jià)
1.分析方法開發(fā)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：
①空白考察：空白溶液無干擾峰出現(xiàn)，應(yīng)該對(duì)測(cè)試無影響（最小干擾＜LOD）；
②分離度：最低分離度標(biāo)準(zhǔn)為，各相鄰峰間分離度＞2.0（最小1.5）；
③LOQ：確認(rèn)靈敏度（響應(yīng)值）最小的2個(gè)，將LOQ試驗(yàn)出來，LOQ對(duì)應(yīng)濃度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%），且LOQ的S/N要大于10；
④加標(biāo)回收標(biāo)準(zhǔn)（90-110%）；
⑤溶液穩(wěn)定性：100%加標(biāo)溶液考察0、2、4、8、24小時(shí)的穩(wěn)定性，主要考察峰面積RSD%（n=5）以及各溶劑的回收率%。
結(jié)語：干一行愛一行！冰凍三尺非一日之寒！需要我們不斷學(xué)習(xí)探究，不斷去實(shí)踐不斷扎實(shí)自己，對(duì)GC方法開發(fā)同時(shí)也需要我們?cè)鷮?shí)的儀器分析基本功，對(duì)GC色譜理論知識(shí)的剖析和挖掘，更要我們對(duì)GC儀器的熟練操作能力，這樣我們的工作會(huì)事半功倍。
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